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  2. 实验四  乳品中维生素含量的测定
    维生素是一类性质各异的低相对分子质量有机化合物，在生物体的生命活动中具有十分重要的作用，是维持人体正常生理生化功能不可缺少的营养物质。但大部分维生素人体自身不能合成，必须通过食物补充。牛乳是各种维生素的优良来源，它含有几乎所有种类的脂溶性和水溶性维生素，可以提供相当数量的核黄素、维生素A、维生素B6和维生素B12。牛乳中还含有少量维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素D、维生素E和维生素K1。
    【实验目的】
    （1）了解乳品中主要维生素的种类；
    （2）掌握乳品中重要维生素的测定方法。
    Ⅰ  乳品中维生素A、D、E含量的测定
    维生素A、维生素D和维生素E是机体维持正常代谢和机能必需的脂溶性维生素。维生素A又称为视黄醇，具有促进机体生长、维持表皮完整、生殖、骨骼及视觉等功能；维生素D主要包括维生素D2（麦角钙化醇）和D3（胆钙化醇），它们对哺乳动物有促进钙、磷代谢及成骨作用；维生素E又称为生育酚，其中以-生育酚的生物效应最高，具有促进生育、抗衰老的作用。由于这3种维生素在外界环境中不稳定，很容易受光照、氧气等影响而被氧化破坏，影响因素较多，因此维生素A、D和E的同时测定目前仍然是检验技术的关键。食品中脂溶性维生素多是以酯类形式存在，极少为游离状态，此外食品中的类脂类化合物也是脂溶性维生素测定的主要干扰来源。因此本实验采用先将样品皂化，使待测维生素游离出来，然后用反相色谱法进行检测。
    一、实验原理
    试样皂化后，经石油醚萃取，维生素A、E用反相色谱法分离，外标法定量；维生素D用正相色谱法净化后，反相色谱法分离，外标法定量。
    二、试剂和仪器
    1. 试  剂
    除非另有规定，本实验所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T 6682规定的一级水。
    （1）-淀粉酶：酶活力≥1.5 U/mg；
    （2）无水硫酸钠；
    （3）氢氧化钾水溶液：称取固体氢氧化钾250 g，加入200 mL水溶解；
    （4）异丙醇：色谱纯；
    （5）乙醇：色谱纯；
    （6）石油醚：沸程30～60C；
    （7）甲醇：色谱纯；
    （8）正己烷：色谱纯；
    （9）环己烷：色谱纯；
    （10）维生素C的乙醇溶液：15 g/L；
    （11）维生素A、D、E标准溶液；
    （12）维生素A标准储备液（视黄醇）（100 g/mL）：精确称取10 mg维生素A标准品，用乙醇溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中；
    （13）维生素E标准储备液（-生育酚）（500 g/mL）：精确称取50 mg维生素E标准品，用乙醇溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中；
    （14）维生素D2标准储备液（100 g/mL）：精确称取10 mg维生素D2标准品，用乙醇（4）溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中；
    （15）维生素D3标准储备液（100 g/mL）：精确称取10 mg维生素D3标准品，用乙醇（4）溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中；
    注：维生素A、D、E标准储备液均须－10C以下避光储存。标准工作液临用前配制。标准储备溶液用前需校正，见附录B。
    2. 仪  器
    （1）高效液相色谱仪，带紫外检测器；
    （2）旋转蒸发器；
    （3）恒温磁力搅拌器：20～80C；
    （4）氮吹仪；
    （5）离心机：转速≥5 000 r/min；
    （6）培养箱：60C±2C；
    （7）天平：感量为0.1 mg。
    三、实验步骤
    （一）试样处理
    1. 含淀粉的试样
    称取混合均匀的固体试样约5 g或液体试样约50 g（精确到0.1 mg）于250 mL三角瓶中，加入1g-淀粉酶，固体试样需用约50 mL 45～50C的水使其溶解，混合均匀后充氮，盖上瓶塞，置于60C±2C培养箱内培养30 min。
    2. 不含淀粉的试样
    称取混合均匀的固体试样约10 g或液体试样约50 g（精确到0.1 mg）于250 mL三角瓶中，固体试样需用约50 mL 45～50C水使其溶解，混合均匀。
    测定维生素D的试样需要同时做回收率实验。
    （二）待测液的制备
    （1）皂化：于上述处理的试样溶液中加入约100 mL维生素C的乙醇溶液，充分混匀后加25 mL氢氧化钾水溶液，混匀，放入磁力搅拌棒，充氮排出空气，盖上胶塞。1 000 mL烧杯中加入约300 mL水，将烧杯放在恒温磁力搅拌器上，当水温控制在53C±2C时，将三角瓶放入烧杯中，磁力搅拌皂化约45 min后，取出立刻冷却到室温。
    （2）提取：用少量的水将皂化液全部转入500 mL分液漏斗中，加入100 mL石油醚，轻轻摇动，排气后盖好瓶塞，室温下振荡约10 min后静置分层，将水相转入另一500 mL分液漏斗中，按上述方法进行第二次萃取。合并醚液，用水洗至近中性。醚液通过无水硫酸钠过滤脱水，滤液用500 mL圆底烧瓶收集，于旋转蒸发器上在40C±2C充氮条件下蒸至近干（绝不允许蒸干）。残渣用石油醚转移至10 mL容量瓶中，定容。
    （3）从上述容量瓶中准确移取2.0 mL石油醚溶液，放入试管A中，再准确移取7.0 mL石油醚溶液放入另一试管B中，将两支试管置于40C±2C的氮吹仪中，将试管中的石油醚吹干。向试管A中加5.0 mL甲醇，振荡溶解残渣。向试管B中加2.0 mL正己烷，振荡溶解残渣。再将试管A和试管B以不低于5 000 r/min的转速离心10 min，取出静置，冷却至室温后待测。A管用来测定维生素A、E的含量，B管用来测定维生素D的含量。
    （三）测  定
    1. 维生素A、E的测定
    （1）色谱参考条件
    色谱柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，5 m，或具同等性能的色谱柱。
    流动相：甲醇。
    流速：1.0 mL/min。
    检测波长：维生素A 325 nm；维生素E 294 nm。
    柱温：35C±1C。
    进样量：20 L。
    （2）维生素A、E标准曲线的绘制
    按表2-4-1分别准确吸取维生素A标准储备液0.50，1.00，1.50，2.00，2.50 mL于50 mL棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度，混匀。此标准系列工作液浓度分别为1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 g/mL。
    表2-4-1  维生素A的含量测定标准曲线绘制
    试管号 S1 S2 S3 S4 S5
    维生素A标准储备液体积/mL 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50
    乙醇体积/mL 定容至50 mL
    标准系列工作液浓度/（g/mL） 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00
    要求：标准曲线的相关系数R2必须控制在0.99以上。
    按表2-4-2分别准确吸取维生素E标准储备液1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL于50 mL棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度，混匀。此标准系列工作液浓度分别为10.0，20.0，30.0，40.0，50.0 g/mL。
    表2-4-2  维生素E的含量测定标准曲线绘制
    试管号 S1 S2 S3 S4 S5
    维生素E标准储备液体积/mL 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00
    乙醇体积/mL 定容至50 mL
    标准系列工作液浓度/（g/mL） 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0
    要求：标准曲线的相关系数R2必须控制在0.99以上。
    分别将维生素A、E标准工作液注入液相色谱仪中（色谱图参见附录D），得到峰高（或峰面积）。
    以峰高（或峰面积）为纵坐标，维生素A、E标准工作液浓度为横坐标分别绘制维生素A、E标准曲线。
    （3）维生素A、E试样的测定
    将试液注入液相色谱仪中，得到峰高（或峰面积），根据各自的标准曲线得到待测溶液中维生素A、E的浓度。
    2. 维生素D的测定
    （1）维生素D待测液的净化
    色谱参考条件
    色谱柱：硅胶柱，150 mm×4.6 mm，或具同等性能的色谱柱。
    流动相：环己烷与正己烷按体积比1∶1混合，并按体积分数0.8%加入异丙醇。
    流速：1 mL/min。
    波长：264 nm。
    柱温：35C±1C。
    进样体积：500 L。
    净化：取约0.5 mL维生素D标准储备液于10 mL具塞试管中，在40C±2C的氮吹仪上吹干。
    残渣用5 mL正己烷振荡溶解，取该溶液50 L注入液相色谱仪中测定，确定维生素D的保留时间。然后将500 L待测液注入液相色谱仪中，根据维生素D标准溶液保留时间收集维生素D洗出液于试管C中。将试管C置于40C±2C的氮吹仪中吹干，取出准确加入1.0 mL甲醇，振荡溶解残渣，即为维生素D测定液。
    （2）维生素D测定液的测定
    ① 色谱参考条件
    色谱柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，5m，或具同等性能的色谱柱。
    流动相：甲醇（4.7）。
    流速：1 mL/min。
    检测波长：264 nm。
    柱温：35C±1C。
    进样量：100 L。
    ② 标准曲线的绘制
    按表2-4-3分别准确吸取维生素D2（或D3）标准储备液0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL于100 棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为0.200，0.400，0.600，0.800，1.000 g/mL。
    表2-4-3  维生素D的含量测定标准曲线绘制
    试管号 S1 S2 S3 S4 S5
    维生素D2（或D3）标准储备液体积/mL 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00
    乙醇体积/mL 定容至100 mL
    标准系列工作液浓度/（g/mL） 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000
    要求：标准曲线的相关系数R2必须控制在0.99以上。
    分别将维生素D2（或D3）标准工作液注入液相色谱仪中，得到峰高（或峰面积），参见附录D。以峰高（或峰面积）为纵坐标，维生素D2（或D3）标准工作液浓度为横坐标分别绘制标准曲线。
    ③ 维生素D试样的测定
    吸取维生素D测定液100 L注入液相色谱仪中，得到峰高（或峰面积），根据标准曲线得到维生素D测定液中维生素D2（或D3）的浓度。
    维生素D回收率测定结果记为回收率校正因子f，代入测定结果计算公式，对维生素D含量测定结果进行校正。
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  1. 实验四  乳品中维生素含量的测定
    维生素是一类性质各异的低相对分子质量有机化合物，在生物体的生命活动中具有十分重要的作用，是维持人体正常生理生化功能不可缺少的营养物质。但大部分维生素人体自身不能合成，必须通过食物补充。牛乳是各种维生素的优良来源，它含有几乎所有种类的脂溶性和水溶性维生素，可以提供相当数量的核黄素、维生素A、维生素B6和维生素B12。牛乳中还含有少量维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素D、维生素E和维生素K1。
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    一、实验原理
    试样皂化后，经石油醚萃取，维生素A、E用反相色谱法分离，外标法定量；维生素D用正相色谱法净化后，反相色谱法分离，外标法定量。
    二、试剂和仪器
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    （4）异丙醇：色谱纯；
    （5）乙醇：色谱纯；
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    （7）甲醇：色谱纯；
    （8）正己烷：色谱纯；
    （9）环己烷：色谱纯；
    （10）维生素C的乙醇溶液：15 g/L；
    （11）维生素A、D、E标准溶液；
    （12）维生素A标准储备液（视黄醇）（100 g/mL）：精确称取10 mg维生素A标准品，用乙醇溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中；
    （13）维生素E标准储备液（-生育酚）（500 g/mL）：精确称取50 mg维生素E标准品，用乙醇溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中；
    （14）维生素D2标准储备液（100 g/mL）：精确称取10 mg维生素D2标准品，用乙醇（4）溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中；
    （15）维生素D3标准储备液（100 g/mL）：精确称取10 mg维生素D3标准品，用乙醇（4）溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中；
    注：维生素A、D、E标准储备液均须－10C以下避光储存。标准工作液临用前配制。标准储备溶液用前需校正，见附录B。
    2. 仪  器
    （1）高效液相色谱仪，带紫外检测器；
    （2）旋转蒸发器；
    （3）恒温磁力搅拌器：20～80C；
    （4）氮吹仪；
    （5）离心机：转速≥5 000 r/min；
    （6）培养箱：60C±2C；
    （7）天平：感量为0.1 mg。
    三、实验步骤
    （一）试样处理
    1. 含淀粉的试样
    称取混合均匀的固体试样约5 g或液体试样约50 g（精确到0.1 mg）于250 mL三角瓶中，加入1g-淀粉酶，固体试样需用约50 mL 45～50C的水使其溶解，混合均匀后充氮，盖上瓶塞，置于60C±2C培养箱内培养30 min。
    2. 不含淀粉的试样
    称取混合均匀的固体试样约10 g或液体试样约50 g（精确到0.1 mg）于250 mL三角瓶中，固体试样需用约50 mL 45～50C水使其溶解，混合均匀。
    测定维生素D的试样需要同时做回收率实验。
    （二）待测液的制备
    （1）皂化：于上述处理的试样溶液中加入约100 mL维生素C的乙醇溶液，充分混匀后加25 mL氢氧化钾水溶液，混匀，放入磁力搅拌棒，充氮排出空气，盖上胶塞。1 000 mL烧杯中加入约300 mL水，将烧杯放在恒温磁力搅拌器上，当水温控制在53C±2C时，将三角瓶放入烧杯中，磁力搅拌皂化约45 min后，取出立刻冷却到室温。
    （2）提取：用少量的水将皂化液全部转入500 mL分液漏斗中，加入100 mL石油醚，轻轻摇动，排气后盖好瓶塞，室温下振荡约10 min后静置分层，将水相转入另一500 mL分液漏斗中，按上述方法进行第二次萃取。合并醚液，用水洗至近中性。醚液通过无水硫酸钠过滤脱水，滤液用500 mL圆底烧瓶收集，于旋转蒸发器上在40C±2C充氮条件下蒸至近干（绝不允许蒸干）。残渣用石油醚转移至10 mL容量瓶中，定容。
    （3）从上述容量瓶中准确移取2.0 mL石油醚溶液，放入试管A中，再准确移取7.0 mL石油醚溶液放入另一试管B中，将两支试管置于40C±2C的氮吹仪中，将试管中的石油醚吹干。向试管A中加5.0 mL甲醇，振荡溶解残渣。向试管B中加2.0 mL正己烷，振荡溶解残渣。再将试管A和试管B以不低于5 000 r/min的转速离心10 min，取出静置，冷却至室温后待测。A管用来测定维生素A、E的含量，B管用来测定维生素D的含量。
    （三）测  定
    1. 维生素A、E的测定
    （1）色谱参考条件
    色谱柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，5 m，或具同等性能的色谱柱。
    流动相：甲醇。
    流速：1.0 mL/min。
    检测波长：维生素A 325 nm；维生素E 294 nm。
    柱温：35C±1C。
    进样量：20 L。
    （2）维生素A、E标准曲线的绘制
    按表2-4-1分别准确吸取维生素A标准储备液0.50，1.00，1.50，2.00，2.50 mL于50 mL棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度，混匀。此标准系列工作液浓度分别为1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 g/mL。
    表2-4-1  维生素A的含量测定标准曲线绘制
    试管号 S1 S2 S3 S4 S5
    维生素A标准储备液体积/mL 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50
    乙醇体积/mL 定容至50 mL
    标准系列工作液浓度/（g/mL） 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00
    要求：标准曲线的相关系数R2必须控制在0.99以上。
    按表2-4-2分别准确吸取维生素E标准储备液1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL于50 mL棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度，混匀。此标准系列工作液浓度分别为10.0，20.0，30.0，40.0，50.0 g/mL。
    表2-4-2  维生素E的含量测定标准曲线绘制
    试管号 S1 S2 S3 S4 S5
    维生素E标准储备液体积/mL 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00
    乙醇体积/mL 定容至50 mL
    标准系列工作液浓度/（g/mL） 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0
    要求：标准曲线的相关系数R2必须控制在0.99以上。
    分别将维生素A、E标准工作液注入液相色谱仪中（色谱图参见附录D），得到峰高（或峰面积）。
    以峰高（或峰面积）为纵坐标，维生素A、E标准工作液浓度为横坐标分别绘制维生素A、E标准曲线。
    （3）维生素A、E试样的测定
    将试液注入液相色谱仪中，得到峰高（或峰面积），根据各自的标准曲线得到待测溶液中维生素A、E的浓度。
    2. 维生素D的测定
    （1）维生素D待测液的净化
    色谱参考条件
    色谱柱：硅胶柱，150 mm×4.6 mm，或具同等性能的色谱柱。
    流动相：环己烷与正己烷按体积比1∶1混合，并按体积分数0.8%加入异丙醇。
    流速：1 mL/min。
    波长：264 nm。
    柱温：35C±1C。
    进样体积：500 L。
    净化：取约0.5 mL维生素D标准储备液于10 mL具塞试管中，在40C±2C的氮吹仪上吹干。
    残渣用5 mL正己烷振荡溶解，取该溶液50 L注入液相色谱仪中测定，确定维生素D的保留时间。然后将500 L待测液注入液相色谱仪中，根据维生素D标准溶液保留时间收集维生素D洗出液于试管C中。将试管C置于40C±2C的氮吹仪中吹干，取出准确加入1.0 mL甲醇，振荡溶解残渣，即为维生素D测定液。
    （2）维生素D测定液的测定
    ① 色谱参考条件
    色谱柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，5m，或具同等性能的色谱柱。
    流动相：甲醇（4.7）。
    流速：1 mL/min。
    检测波长：264 nm。
    柱温：35C±1C。
    进样量：100 L。
    ② 标准曲线的绘制
    按表2-4-3分别准确吸取维生素D2（或D3）标准储备液0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL于100 棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为0.200，0.400，0.600，0.800，1.000 g/mL。
    表2-4-3  维生素D的含量测定标准曲线绘制
    试管号 S1 S2 S3 S4 S5
    维生素D2（或D3）标准储备液体积/mL 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00
    乙醇体积/mL 定容至100 mL
    标准系列工作液浓度/（g/mL） 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000
    要求：标准曲线的相关系数R2必须控制在0.99以上。
    分别将维生素D2（或D3）标准工作液注入液相色谱仪中，得到峰高（或峰面积），参见附录D。以峰高（或峰面积）为纵坐标，维生素D2（或D3）标准工作液浓度为横坐标分别绘制标准曲线。
    ③ 维生素D试样的测定
    吸取维生素D测定液100 L注入液相色谱仪中，得到峰高（或峰面积），根据标准曲线得到维生素D测定液中维生素D2（或D3）的浓度。
    维生素D回收率测定结果记为回收率校正因子f，代入测定结果计算公式，对维生素D含量测定结果进行校正。
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  1. 第一章  基础实验 1
    实验一  水分含量的测定 1
    实验二  粗淀粉含量的测定 4
    实验三  还原糖含量的测定 8
    实验四  总酸含量的测定 12
    实验五  酱、腌制品中亚硝酸盐含量的测定 16
    实验六  酱油中氨基酸态氮含量的测定 19
    实验七  食品中黄曲霉毒素B1含量的测定 22
    实验八  发酵乳中脂肪含量的测定 29
    实验九  酱油中可溶性无盐固形物含量的测定 33
    实验十  泡菜中挥发性酸度的测定 35
    实验十一  酱类过氧化值的测定 38
    实验十二  食醋中非挥发性酸（乳酸计）含量的测定 40
    实验十三  酱油中总氮含量的测定 43
    实验十四  酒样中酒精度的测定 47
    实验十五  酒样中固形物含量的测定 50
    实验十六  酒样中甲醇含量的测定 52
    实验十七  啤酒中甲醛含量的测定 55
    实验十八  啤酒中二氧化碳含量的测定 59
    实验十九  啤酒中双乙酰含量的测定 63
    实验二十  啤酒中蔗糖转化酶的活性分析 66
    实验二十一  葡萄酒、果酒中二氧化硫含量的测定 68
    实验二十二  葡萄酒、果酒中二氧化碳含量的测定 71
    实验二十三  蛋白酶活力的测定 73
    实验二十四  麦芽糖化力的测定 77
    实验二十五  液化型淀粉酶活力的测定 81
    实验二十六  多酚氧化酶活力的测定 84
    实验二十七  纤维素酶活力的测定 86
    第二章  综合实验 89
    实验一  复合调味品中系列添加剂含量的测定 89
    Ⅰ  复合调味品中山梨酸、苯甲酸含量的测定 89
    Ⅱ  复合调味品中番茄红素含量的测定 91
    Ⅲ  复合调味品中茶多酚含量的测定 94
    Ⅳ  复合调味品中环己基氨基磺酸钠（甜蜜素）含量的测定 96
    实验二  腌肉中系列添加剂含量的测定 98
    Ⅰ  腌肉中赤藓红及其铝色淀含量的测定 98
    Ⅱ  腌肉中没食子酸丙酯含量的测定 99
    Ⅲ  腌肉中硝酸钠含量的测定 101
    实验三  腐乳中生理活性物质分析 103
    Ⅰ  腐乳中大豆多肽含量的测定 103
    Ⅱ  腐乳中超氧化物歧化酶活力的测定 107
    Ⅲ  腐乳中异黄酮含量的测定 109
    Ⅳ  腐乳中低聚糖含量的测定 112
    Ⅴ  腐乳中游离氨基酸成分分析 114
    实验四  乳品中维生素含量的测定 117
    Ⅰ  乳品中维生素A、D、E含量的测定 117
    Ⅱ  乳品中维生素B1含量的测定 122
    Ⅲ  乳品中维生素B2含量的测定 125
    Ⅳ  乳品中维生素B6含量的测定 127
    Ⅴ  乳品中维生素B12含量的测定 130
    Ⅵ  乳品中维生素C含量的测定 134
    Ⅶ  乳品中维生素K1含量的测定 136
    实验五  浓香型白酒中风味成分的检测 140
    Ⅰ  白酒中挥发性风味成分的检测 140
    Ⅱ  白酒中总酯含量的检测 142
    Ⅲ  白酒中乙酸乙酯含量的测定 144
    第三章  设计性实验 147
    实验一  泡菜安全性评价 147
    实验二  酒类色度分析实验 149
    实验三  宜宾芽菜中乳酸菌总数的测定 151
    实验四  香菇多糖分析实验 153
    附  录 155
    参考文献 168
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